软骨再生，GelMA生物墨水Biofabrication!

近年来，工程仿生细胞微环境一直是再生医学的重中之重。排列成弓形的 II 型胶原蛋白形成关节软骨中主要的纤维网络。由于缺乏能够产生 3D 纤维结构的合适微细加工技术，弓状软骨组织的体外复制构成了主要挑战之一。

来自印度理工学院德里分校的Sourabh Ghosh团队报告了一种使用两种类型的生物墨水、甲基丙烯酰化明胶 (GelMA) 和丝素蛋白-明胶 (SF-G) 制造拱形结构的 3D 生物打印方法。与 GelMA 结构相比，生物打印的 SF-G 结构显示封装的人骨髓间充质干细胞增殖增加。生化分析、基因和蛋白质表达表明 SF-G 在形成纤维胶原网络和软骨形成方面具有优越的作用。本研究使用 Metascape 进行的蛋白质-蛋白质相互作用研究评估了所涉及蛋白质的功能。使用 Col 2A1、SOX 9、ACAN 和 RT-PCR 中第 21 天上调的基因，即 SF-G 中的 β-catenin、TGFβR1、Col 1A1 和 GelMA 中的 PRG4、Col 10A1、MMP 13 进行进一步的 GeneMANIA 和 STRING 体外分析。这些发现强调了 SF-G 在调节 Wnt/β-连环蛋白和 TGF-β 信号通路中的作用。因此，3D 生物打印的拱形结构具有软骨再生的巨大潜力。相关工作以题为“Development of a biomimetic arch-like 3D bioprinted construct for cartilage regeneration using gelatin methacryloyl and silk fibroin-gelatin bioinks”的文章发表在2023年4月14日的国际知名期刊《Biofabrication》。

1. 创新型研究内容

本研究的研究路径是在图 1(A) 中显示的 Python 脚本的帮助下生成的，使用代表关节软骨不同区域的 G 代码模拟器。图 1(B) 和 (C) 显示了生物打印后 GelMA 和 SF-G 构造的拱形结构。然后本研究评估了每种水凝胶的可印刷性。对于每一种生物墨水，都测量了细丝展开率，定义为印刷细丝的宽度除以针的直径。SF-G 表现出最低的铺展比 (1.72 ± 0.104)，而使用 GelMA 观察到的铺展比为 2.09 ± 0.25)（图 1(E)）。

图1 关节软骨示意图

本研究在第14天进行了活死测定，以确定包封在GelMA和SF-G生物打印构建体中的BM-MSC的活力（图2）。在SF-G条件下，构建体之间有更多的活细胞。在第14天，可以观察到GelMA构建体（89.25%）和SF-G构建体（91.16%）之间的活力百分比存在显着差异（p<0.0001）。

图2 利用3D 生物打印的 GelMA 和 SF-G的第 14 天的活/死检测结果

本研究通过估计生物打印结构中的 DNA 提供细胞增殖的定量证据（图 3）。在软骨形成培养的 21 天内，GelMA 和 SF-G 构建体都表现出相当的 DNA 值（图 3(A)）。在第 7 天观察到 SF-G 的 DNA 含量最高，显着高于同时的 GelMA 构建体 (p < 0.0001)。然而，在培养的第 21 天，两种情况下均观察到增殖率下降。

图3 BM-MSCs 在第 7 天和第 21 天封装 GelMA 和 SF-G 生物打印结构

在分化 1、7 和 21 天后，通过研究表 1 中提到的标记物的相对基因表达来评估关节软骨分化（图 4）。与 GelMA 相比，在 SF-G 生物打印结构中观察到软骨形成标记 Col 2A1、SOX 9 和 ACAN 的表达增加。在第 21 天观察到 SF-G 构建体中 Col 2A1 表达水平显着增加了8.6 倍，远高于第 1 天观察到的水平（4 倍）(p<0.0001)。使用 ACAN 和 SOX 9 观察到类似的趋势，与第 1 天观察到的相比，第 21 天的上调倍数变化为 7.9 和 12.7。

图4 载有 GelMA 和 SF-G 生物打印结构的 BM-MSC 的相对基因表达分析

此外，本研究使用 Metascape 建立了 PPI，Metascape 是一种结合了相互作用组分析、基因注释和功能富集的软件，用于对所有差异证明的基因进行全面的富集分析。分析结果有助于确定与我们研究中使用的输入基因相关的主要生物过程。调查揭示了不同本体概念的独立集群。这些分析结果以热图的形式描述（图 5），其中高度丰富的术语与 GO:0060351 相关：软骨发育涉及软骨内骨形态发生 (−11, −log(P))， WP474：软骨内骨化（-13，log10（P）），GO：0001501：骨骼系统发育（-11.5，-log（P））等。p值为0.01，最小计数为3， 富集因子>1.5 。

图5 Metascape 的基因本体富集热图和蛋白质-蛋白质的相互作用

本研究在第 7 天和第 21 天进行免疫荧光分析，以评估特定胶原蛋白在软骨形成分化培养条件下的沉积（图 6-8）。生物打印的 GelMA 构建体在第 7 天表现出 I 型胶原蛋白的细胞内表达（图 6），但 SF-G 中的表达是细胞外的，细胞呈现出明显的圆形形态。重要的是要注意，与第 7 天相比，第 21 天 GelMA 生物打印构建体的表达水平没有太大差异。而在 SF-G 中，第 7 天的胶原蛋白 I 强度相对高于第 21 天，这与本研究的基因表达结果一致。

图6 免疫荧光分析表征了 GelMA和SF-G中的胶原蛋白 I 的蛋白质表达

关于软骨分化蛋白胶原 II 的表达，发现胶原原纤维均匀分布在 SF-G 中的细胞周围，在软骨分化三周后平行定向（图 7）。与表达水平正常的第 7 天相比，GelMA 和 SF-G在第 21 天明显增强表达。有趣的是，第 21 天在 SF-G 中的表达水平相对高于 GelMA 构建体并且是位于细胞外的，这进一步验证了本研究的基因表达结果。

图7 免疫荧光分析表征了 GelMA和SF-G中的胶原蛋白 II 的蛋白质表达

X 胶原蛋白是细胞肥大的标志物，在第 7 天和第 21 天在 GelMA 构建体中表现出无法区分的表达（图 8）。尽管当时的表达水平很明显，但它在第 7 天主要是细胞内的。构建体内部的细胞具有细长的形态，这不是透明软骨中软骨细胞的典型特征。尽管 SF-G 构建体在第 7 天显示出比 GelMA 增加的胶原蛋白 X 表达，但表达水平在第 21 天下降。值得注意的是，胶原纤维在第 7 天在 SF-G 中呈均匀分布，在第 21 天变得有些分散。

图8 免疫荧光分析表征了 GelMA和SF-G中的胶原蛋白X的蛋白质表达

本研究进行了 ELISA分析 以估计在不同时间点从两种构建体的软骨形成分化下培养基中分泌的胶原蛋白 II 的量（图 9）。GelMA 和 SF-G 构建体分泌的胶原蛋白 II 分别为 271.5–381.5 pg ml^-1和 186.5–256.5 pg ml^-1。随着培养时间的延长，直到第 14 天，在 GelMA 构建体中观察到培养基中胶原蛋白 II 水平的提高；然而，在第 21 天，水平急剧下降，从 381.5–331.5 pg ml^-1 下降。该水平远高于第 1 天观察到的水平 (p < 0.0001)。SF-G 构建体表现出与通过羟脯氨酸测定法估计总胶原蛋白所观察到的趋势相反的趋势。尽管在第 7 天观察到胶原蛋白 II 水平略有增加，但它继续下降直到第 21 天，与第 1 天分泌的数量 (251.5 pg ml^-1) 相比，数量变为 186.5 pg ml^-1 (p< 0.0001 )。

图9 在第 1、7、14 和 21 天封装的 BM-MSC 培养基中分泌胶原 II 的 ELISA 分析

2. 总结与展望

本研究使用 3D 生物打印制造了软骨组织的仿生拱形结构，关注了类似于天然组织中胶原蛋白 II 排列的构造的结构。GelMA 和 SF-G 都显示出软骨形成的潜力。然而，3D 生物打印 SF-G 构建体产生了最好的关节软骨软骨形成，软骨形成特异性标记物 Col 2A1、ACAN、SOX 9 的表达以及肥大标记物 Col 10A1 和 MMP 13 的表达减少均证明了这一点。免疫荧光分析进一步验证了这些特定于胶原蛋白 I、II 和 X 的发现。与 GelMA 不同，SF-G 在 Wnt/β-catenin 和 TGF-β 信号标记物中表现出更好的表达，这在软骨形成中起着重要作用。PPI 网络研究还证实，用于封装 BM-MSC 的 SF-G 为其软骨分化提供了合适的环境。

文章来源：

https://iopscience.iop.org/article/10.1088/1758-5090/acc68f